摘要：以干燥的驴皮张样品为试验材料，将SDS-蛋白酶K法与Chelex-100法相结合，创新性地引入玻璃奶DNA纯化技术，提取全基因组DNA，并将此方法与前人发表的陈旧皮张DNA提取方法和试剂盒提取方法进行比较分析。结果表明，本研究发明方法提取的基因组DNA纯度较高，杂质较少，且操作简单，所用试剂、仪器费用较低，能更好地应用于分子生物学实验。

　　关键词：动物皮张；DNA提取；玻璃奶

　　DNA为分子生物学研究的基础，随着生物领域尤其是遗传学方面研究的日渐深入，从分子水平上对动物进行物种鉴定、物种起源和多样性评估及其亲缘关系研究已获得广泛应用。20世纪80年代就已开始动物皮张标本DNA提取的研究，尽管提取成功的报道很多，但提取的基因组DNA含量较低，片段较短，且难以进行PCR扩增；提取方法虽然不断改善，但得到的DNA质量仍旧不是很高。

　　当前皮张源性鉴定方法滞后，国内外仍然没有统一的技术标准和较成熟的鉴别方法，传统的宏观观察法、显微镜观察法具有一定的主观性，无法准确和快速地区分皮张源性。随着分子生物学技术的发展，基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来。DNA分子鉴定法主要是利用显示生物特征的各生物物种所具有的不同DNA序列信息进行源性鉴别，它可以突破依据动物纤维结构形态进行鉴定的局限性，与传统分析方法相比，更加客观和准确。因此，获得高质量的动物皮张基因组DNA已成为进行皮张源性鉴定研究的迫切要求。

　　本试验以SDS法为基础，将蛋白酶K、Chelex-100与GlassMilkDNA提取技术相结合，并将此方法与前人发表的陈旧皮张DNA提取新方法和DNA提取试剂盒法进行比较分析，旨在研建一种操作简便、DNA提取效率高、花费较为低廉的优化方法，为后续分子生物学实验提供必要条件。

　　1材料与方法

　　1.1试验材料

　　9份干燥的驴皮样品，分别编号为1～9。每份样品平均分为三份，分别用于A、B、C三种方法。材料由山东省农业科学院生物技术研究中心测序中心提供。

　　1.2试验试剂

　　（1）消化缓冲液A（10mmol/LTris-HCl，25mmol/LEDTA，100mmol/LNaCl，0.5%SDS，pH8.0）、Chelex-100、20mg/mL蛋白酶K、氯仿、GlassMilk、DNABindingBuffer、70%酒精、无水乙醇、TE缓冲液、超纯水。

　　（2）消化缓冲液B（10mmol/LTris-HCl，0.5%SDS，1mmol/LCaCl2，0.2mg/mL蛋白酶K，pH8.0）、1μmol/LEDTA、10%Chelex溶液、酚、氯仿、异戊醇、3mol/LNaAc、无水乙醇、75%酒精、TE缓冲液、超纯水。

　　（3）DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.TissueDNAKit）。

　　（4）HiFiBuffer：TransTaqDNAPolymoraseHighFidelity购自北京全式金生物技术有限公司。

　　1.3试验方法

　　1.3.1基因组DNA提取方法A：取约30mg驴皮样品研磨至微粒，分别装到编号为A1～A9的2mLEP管中，加1mL去离子水洗涤2次；加入400μL消化缓冲液A以及380μL5%的Chel-ex-100和20μL20mg/mL的蛋白酶K，50～600C水浴保温，期间搅拌混匀，至全部溶解；取出冷却至室温，振荡5～10s，100℃沸水浴8min；结束后取出样品，10000r/min离心1min，取上清转至新的EP管（记录上清体积），加等体积氯仿，充分混匀，12000r/min离心5min，重复此步骤两次；向收集液中加入5μLGlassMilk，并加600μLDNABindingBuffer.充分混匀，65℃水浴15min；后室温放置5min，8000r/min离心1min，弃上清；加入70%酒精500μL进行洗涤，8000r/min离心1min，重复此步骤两次；加入500μL无水乙醇，吹打悬浮，8000r/min离心1min，弃上清；8000r/min离心30s，用10μL枪头吸走残余液体，室温干燥10min；加入50μLTE缓冲液（pH7.0），70℃水浴5min，快速离心，移至新离心管，-200C保存。

　　方法B参考陈旧皮张DNA提取新方法[12]。

　　方法C参考DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.TissueDNAKit）。

　　1.3.2基因组DNA检测（1）紫外分光光度计检测：每份DNA样品分别取2μL测定其浓度及A260和A280。每个样品做三个生物学重复，取均值。

　　（2）琼脂糖凝胶电泳检测：配置2.0%的琼脂糖凝胶，取1×LoadingBuffer10μL，加入2μL基因组DNA样品，混合均匀后加入点样孔中，同时加入DNAMarker，180V电泳10min。电泳结束后，利用凝胶成像仪进行拍摄，保存图像，根据样品的条带亮度、整齐度及位置，粗略估计其纯度及片段大小。

　　（3）PCR扩增检测：根据驴线粒体基因组（16SrRNA）细胞色素b特异序列，利用PrimerPremier5.0设计PCR引物，上游引物MtUF：5'-ATAAGACGAGAAGACCCTATCCAGC-3'，下游引物MtUR：5-ACCAITITCTGITCTCCGAGGTCAC-3'，扩增目的片段250bp。在扩增之前分别将三种方法提取的共27份基因组DNA稀释到100ng/yL待用。PCR反应总体积为25μL，其中ExTaq聚合酶0.2μL，HiFiBuffer2.5μL，dNTP2.0μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，模板2.0μL，ddH2016.3μL。

　　2结果与分析

　　2.1三种方法提取的基因组DNA紫外分光光度计检测

　　由表1可知，A、B、C三种方法获得的DNA质量在A260和A280值上有明显区别，B方法的A260值最高达100以上，A280值最高也达到50以上；C方法虽然A260和A280值比B方法稍低，但总体上数值仍然偏高。原因可能是B和C两方法提取的DNA纯度不高，含有较多苯酚、盐酸胍、聚乙二醇等杂质。过多的杂质污染进而导致样品浓度过高，两方法获得DNA浓度均大于500ng/μL，远高于方法A的DNA浓度。利用方法A提取的DNA浓度范围为74.8～177.5ng/μL，A260/A280在2.0左右，虽仍有部分RNA污染，但DNA纯度相对B、C两方法要好。

　　2.2三种方法提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳分析

　　从琼脂糖凝胶电泳图可以看出，三种方法均可从驴皮张中提取出基因组DNA，但获得的DNA量有显著差别。其中A方法的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图条带最弱，出现拖带现象，提取量最少（图1）；B方法的基因组DNA提取量相对A方法稍多，但DNA降解较为严重，且杂质较多，不够纯净（图2）；C方法的基因组DNA提取量相对于A、B两方法最多，条带最为明亮，提取效果最好，但存在降解现象及RNA等杂质污染（图3）。

　　2.3三种方法提取的基因组DNA的PCR扩增检测

　　以三种方法提取的基因组DNA为模板，设计合成的引物扩增目的片段。由图4～6可知，三种方法均能很好地进行目的片段的扩增，且条带清晰，带型整齐，说明三种方法均能从干燥的驴皮张中提取较好质量的基因组DNA，且都能够应用于后续的分子生物学实验。

　　3结论与讨论

　　玻璃奶是一种特殊制备的以二氧化硅作为悬浮物的水溶液，具备快速、定量、特异性结合DNA的能力，可以取代有毒的有机物苯酚、氯仿等用于分离和纯化DNA。在高盐溶液中，核酸是不溶的，可被吸附至玻璃基质上，而蛋白质在高盐溶液中是高度溶解的，脂类物质悬浮于溶液表面，从而起到纯化分离DNA的作用。将二氧化硅用于DNA的纯化最早见于Engelstein等的报道，他们采用此法纯化出了测序级的模板DNA。该法不仅杜绝了如酚、氯仿等对身体有毒害药品的使用，而且可达到高效、快速、批量提取DNA的目的，具有经济、实用、高效、无毒的特点。本研究利用SDS-蛋白酶K结合Chelex-100法提取动物皮张中的微量DNA，能获取较高浓度的DNA，进一步利用玻璃奶DNA纯化技术能显著去除残留的蛋白和金属离子等污染，显著提高了DNA纯度。

　　将本研究使用Chelex-100结合玻璃奶提取驴皮张全基因组DNA的方法与前人报道方法和试剂盒法提取所得基因组DNA分别利用紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳以及PCR扩增技术进行评估，综合分析可知，A方法所提基因组DNA虽然量较少但纯度较高，电泳均能显示出条带，并且能够很好地扩增目的片段，满足分子生物学实验要求，此外，所用试剂、仪器费用较低且操作较为简单，耗时14小时，相对B方法时间较短。B方法获取的基因组DNA浓度较高，也能用于PCR扩增目的条带，虽然操作以及仪器试剂和A方法相似，但基因组DNA电泳条带及吸光值显示其存在蛋白质、RNA以及其他杂质污染，且电泳条带也不是很整齐，耗时20小时，时间相对较长。C方法所提基因组DNA浓度居中，条带清晰整齐，能很好地进行目的片段PCR扩增，但从其吸光值来看，可能存在较多的酚、聚乙二醇、盐酸胍等杂质污染，且试剂盒价格相对较为昂贵。

　　综上所述，本研究三种方法均可用于干燥动物皮张基因组DNA的提取，通过对比分析，方法A即本研究发明的SDS-蛋白酶K结合Chelex-100法和玻璃奶纯化技术提取获得的基因组DNA纯度较高，杂质较少，且操作简单，所用仪器、试剂均价格低廉，相对于方法B和C能更好地应用于分子生物学实验。